在冬季低温影响下，污水处理厂氮污染物去除效果也容易出现反复。硫自养反硝化法以运行成本低、效率高、工艺简单等特性受关注，尤其是在低温低碳氮比条件下的应用更是突出。本文以颗粒硫磺和黄铁矿的硫自养反硝化反应器为研究对象，进行详细数据记录。
污水低温脱氮：硫自养反硝化法效果显著
由于冬季低温的影响，中国北方污水处理厂常面临季节性TN超标的问题。此外，受制于市政污水低碳氮比的水质特性，污水处理厂也面临着异养反硝化不充分而导致的TN超标问题。与异养反硝化相比，硫自养反硝化是以还原态硫为电子供体，NO3--N为电子受体进行的自养反硝化过程，能够有效地去除水中的NO3--N.硫自养反硝化因无需外加碳源、运行成本低、污泥产量少、效率高、工艺简单等优点而得到广泛关注。目前，Li等将硫自养反硝化工艺应用于低温、低碳氮比条件下污水处理厂氮污染物的去除，并达到了90%以上的氮去除效果。另一方面，硫自养反硝化过程作为冬季或低碳比条件下的脱氮保障工艺，常面临季节性、间歇性运行的操作方式。但是针对硫自养反硝化工艺饥饿忍耐后能力恢复及其对微生物菌群结构影响的研究却鲜见报道。
近年来，分子生物学作为有效手段用来研究污水处理过程中微生物群落结构特性，如变形梯度凝胶电泳、克隆文库和高通量测序等。MiSeq高通量测序以Illumina的测序技术为基础，通过可逆终止试剂方法对数百万个基因片段同时进行大规模平行测序，具有分析结果、高速等特点，被广泛应用于污水处理过程中微生物结构和多样性研究。
本文以颗粒硫磺和黄铁矿的硫自养反硝化反应器为研究对象，探究反应器在经过30 d饥饿忍耐后的恢复情况，并利用MiSeq高通量测序对饥饿忍耐前后反应器中细菌群落的变化情况进行分析，以期为污水处理厂脱氮保障工艺的季节性、间歇性运行提供技术参考。
1材料与方法
1.1试验装置
硫自养反硝化工艺采用降流式生物滤池，试验装置示意图如图 1所示。反应器为密封的有机玻璃柱，内径140 mm，高度1 170 mm，填充高度500 mm，有效容积5.94 L.进水口距柱底600 mm，沿反应器不同高度处分别设置取填料口，取填料口距填料顶部的距离分别是100 mm和300 mm。
图 1 试验装置示意
试验共设2个反应器(分别记为1号、2号)，1号反应器加入硫磺和白云石的混合物，2号反应器加入黄铁矿和白云石的混合物。 2个反应器中的填料均按1:1的体积比混合装填，硫磺、黄铁矿和白云石的粒径均为5——10 mm.其中，硫磺/白云石的填充区域孔隙率为45.9%，黄铁矿/白云石为44.1%。
1.2 进水水质和接种污泥
本试验用水为人工模拟污水厂尾水，水质指标为： NO3--N浓度为30 mg˙L-1，NH4+-N浓度为2 mg˙L-1，TP浓度为1 mg˙L-1，COD浓度为18——23 mg˙L-1，pH为6.8——7.2.接种污泥取自高碑店污水处理厂二沉池回流污泥。
1.3 反应器运行方式
反应器在低温下运行85 d (1月2日至3月26日)，主要分为稳定期、饥饿期和恢复期：稳定期(1——30 d)，正常进水，反应器稳定运行，平均温度为12℃；饥饿期(31——60 d)，停止进水，反应器处于饥饿状态，平均温度12.8℃；恢复期(61——85 d)，恢复进水，反应器进入恢复期，平均温度为14℃。饥饿期结束后及恢复期采集反应器中的污泥样品(1号饥饿期A1、恢复期A2；2号饥饿期B1、恢复期B2) 进行MiSeq高通量测序分析，分析反应器饥饿期及稳定期细菌群落的变化情况。
1.4 测试指标和方法1.4.1 水质指标的测定
反应器运行期间，定期采样进行水质指标的测定，检测项目包括硝酸盐氮(NO3--N)、亚硝氮(NO2--N)、总氮(TN)、总磷(TP) 等。其中NO3--N采用紫外分光光度法测定；NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定；TN采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定；TP采用钼酸盐分光光度测定。试验所用分光光度计为HACH DR5000紫外可见分光光度计。生物量采用脂磷法测定。
1.4.2 微生物多样性的测定
DNA的提取与PCR的扩增：为了探究系统的细菌群落，在反应的饥饿期和恢复期进行取样。采用E. Z. N. A. Soil DNA试剂盒(美国Omega公司)，按照试剂盒说明书提供的操作步骤提取。提取的DNA用1%琼脂凝胶电泳进行检测。 PCR的扩增区域为16S rRNA的V3-V4区，细菌16S rRNA扩增引物采用通用引物(338F/806R)。引物名称和引物序列分别是338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) 和806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。 PCR反应体系： Forward primer (10 μmol˙L-1)，2 μL；Reverse primer (10 μmol˙L-1)，2 μL；dNTPs (2.5 mmol˙L-1)，4 μL；10×PCR buffer，5 μL；Pyrobest DNA Polymerase (2.5 U˙μL-1)，0.3 μL；补充ddH2O至50 μL.反应程序：先95℃预热5 min；然后进行25个循环(95℃变形30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s)，后72℃延伸10 min.用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(Axygen公司) 回收PCR产物，经Tris-HCl洗脱后，用2%琼脂糖凝胶电泳检测。根据电泳结果。将PCR产物用QuantiFluorTM -ST (Promega公司) 进行定量，按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合。
MiSeq文库构建与测序：用高通量测序平台Illumina MiSeq对扩增产物进行MiSeq高通量测序。测序得到的PE reads根据overlap关系进行拼接，同时过滤掉低质量的reads，区别样品后进行OUT聚类分析和物种分类学分析。
生物多样性和分类学分析：首先将序列按照彼此的相似性归为操作分类单元(OTU)。按照97%相似性进行OUT聚类，采用RDP classifier对97%相似水平的OUT代表序列进行分类学分析。利用MOTHUR软件对样品覆盖率(coverage percentage)，ACE，Chao丰富指数以及Shannon多样性指数进行计算。同时为了保证分析的高可信度，根据SILVA106库中的参考序列对OUT进行种属鉴定，种属比对的可信度阈值设定为80%.
2结果与讨论
2.1反应器运行情况
稳定期、饥饿期和恢复期的硫自养1号和2号反应器进出水水质的变化情况如图 2所示。进水NO3--N、NO2--N、TN和TP平均浓度分别为30.00、0.01、35.88和1.00 mg˙L-1.稳定期，反应器在低温下(12℃) 运行30 d后，1号反应器出水NO3--N、NO2--N、TN和TP浓度分别为1.78、0.03、2.87和0.91 mg˙L-1，TN去除率为91.9%，1号反应器具有较高的脱氮效果。 2号反应器出水NO3--N、NO2--N、TN和TP浓度分别为11.32、0.11、13.10和0.14 mg˙L-1，TN和TP去除率分别为63.49%和86.41%. 2号反应器具有同步脱氮除磷的效果。
图 2 饥饿前后反应器NO3--N、NO2--N、TN、TP的变化
反应器稳定运行后，停止进水，进入饥饿期。经过30 d的饥饿忍耐后，反应器在低温下(14℃) 恢复进水，进入恢复期。由图 2可以看出，饥饿忍耐后，1号反应器出水NO3--N增加到27.87 mg˙L-1，2号反应器出水NO3--N增加到26.56 mg˙L-1.但随着反应器的恢复，出水NO3--N浓度逐渐降低，1号反应器经5 d的恢复(第65 d)，出水NO3--N和TN浓度分别为0.38 mg˙L-1和2.37 mg˙L-1，去除率分别为98.8%和93.6%；2号反应器经11 d的恢复(第71 d)，出水NO3--N和TN浓度分别为10.51 mg˙L-1和12.91 mg˙L-1，去除率为66.40%和65.57%.其次，在恢复期2个反应器的出水NO2--N浓度均呈现先增加后降低的趋势，恢复初期均出现NO2--N的积累。由图 2可知，1号反应器恢复期第3 d (第63 d) 出水NO2--N浓度为2.17 mg˙L-1；2号反应器恢复期第5 d(第65 d)，出水NO2--N浓度为0.37 mg˙L-1.随着反应器稳定运行，终1号反应器NO2--N浓度下降到0.1 mg˙L-1以下，2号反应器有0.1 mg˙L-1 NO2--N的积累量。此外，饥饿忍耐未对2号反应器TP的去除效果产生明显的影响。原因如下，2号反应器对磷的去除主要是通过黄铁矿中的铁与磷结合形成铁磷沉淀物及铁的氧化物和氢氧化物对磷有吸附作用，饥饿条件下并未明显影响这一物理化学过程。结果表明，与1号反应器相比，2号反应器的恢复时间略长，但2个反应器都能在低温、短期内恢复到正常处理效果。
饥饿期(第60 d) 及恢复期(第85 d) 反应器不同高度处微生物量的变化如表 1所示。从中可知，1号和2号反应器饥饿忍耐后不同高度处微生物量均低于恢复期。分析原因，主要是饥饿期间反应器中部分微生物对饥饿环境的忍耐能力差，裂解死亡；部分细菌因营养物质缺乏而进入休眠状态，不能进行生长繁殖。反应器恢复进水后，生物膜的活性和生长可得到不同程度的恢复，使得微生物量有所增加，同时反硝化性能得以恢复。
表 1 饥饿忍耐前后反应器不同高度处生物量的变化/nmol˙g
